● 拉曼光譜原理
拉曼散射光譜是用于研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子光譜技術(shù)，已有將近九十年的歷史。早在1923年，史梅耳（A. Smekal）便從理論上預(yù)言了入射單色光照射物質(zhì)的光波頻率發(fā)生改變的現(xiàn)象的存在。1928年，印度物理學(xué)家拉曼在研究液體苯的散射實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)散射光頻率改變現(xiàn)象，并用分子振動(dòng)能級(jí)與虛能級(jí)對(duì)這種散射現(xiàn)象進(jìn)行解釋，因而稱為拉曼散射。拉曼光譜是通過(guò)散射光的頻移量來(lái)獲得分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)情況，從而分析分子的結(jié)構(gòu)、對(duì)稱性、電子環(huán)境和分子結(jié)合情況，是定量和定性分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種強(qiáng)有力的分析技術(shù)。
圖 拉曼及瑞利散射能級(jí)示意圖
拉曼光譜是由于光學(xué)模晶格振動(dòng)、電荷密度起伏、自旋密度起伏、電子躍遷以及它們的耦合等因素引起的。當(dāng)以一定頻率的光源激發(fā)樣品時(shí)，會(huì)產(chǎn)生彈性和非彈性散射現(xiàn)象。大部分分子發(fā)生彈性碰撞，光子的頻率沒(méi)有改變或者說(shuō)波長(zhǎng)與能量沒(méi)有任何改變，不進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移；小部分分子發(fā)生非彈性碰撞，由于勵(lì)磁或失活的分子振動(dòng)使光子可能會(huì)失去或增加一些能量，頻率發(fā)生改變。當(dāng)入射光波在分子中傳播擴(kuò)散時(shí)，以下三種類型的現(xiàn)象可能發(fā)生，如圖所示：
首先，當(dāng)一束光線照射分子時(shí)，它可以與其進(jìn)行能量交換，但分子的凈能量交換
為零，所以散射光頻率與入射光相同，即
，這個(gè)過(guò)程被稱為瑞利散射。
第二，入射光能夠與分子進(jìn)行能量交換而且凈交換能量是一個(gè)分子的振動(dòng)能量。如果這種相互作用使光子獲得振動(dòng)能量，則散射光頻率與入射光相比變高，即
，稱為反-斯托克斯散射。
第三，如果光與分子相互作用使分子獲得能量，而光子失去能量，則光子的頻率會(huì)降低，散射光與入射光相比能量降低，即
，這個(gè)過(guò)程被稱為斯托克斯拉曼散射。
從拉曼散射形成機(jī)理可以確認(rèn)，拉曼散射光能量等于入射光能量加上或減去分子振動(dòng)能級(jí)的能量差，即拉曼散射光的頻率取決于激發(fā)光的入射頻率。
4.1.2拉曼發(fā)展歷史
拉曼散射現(xiàn)象雖然在20世紀(jì)20年代就被理論預(yù)言并被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但是，拉曼光譜儀卻是隨60年代激光的問(wèn)世、計(jì)算機(jī)的普遍使用，70年代引進(jìn)激光探針之后才成為實(shí)用的、商業(yè)化的光譜分析儀器。從20世紀(jì)末到本世紀(jì)初，陷波濾波、探測(cè)器和微機(jī)械等技術(shù)應(yīng)用在拉曼光譜領(lǐng)域之后，拉曼光譜儀發(fā)展成為具備高分辨率、高靈敏度、高響應(yīng)速度的分子結(jié)構(gòu)分析儀器。
在30年代拉曼光譜以汞弧燈作為光源，主要應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究。拉曼光譜由于光譜強(qiáng)度極其微弱，應(yīng)用受到了限制。特別是40年代以后，紅外光譜得到迅猛發(fā)展，拉曼光譜也因此停滯不前。
上世紀(jì)60年代，激光出現(xiàn)并投入生產(chǎn)，光電轉(zhuǎn)換器件也逐漸發(fā)展壯大，拉曼光譜分析技術(shù)逐漸蓬勃發(fā)展起來(lái)。激光光源具有能量高、單色性好以及相干性好等優(yōu)勢(shì)，極大的保障了拉曼光譜的分辨率與實(shí)用性。與此同時(shí)，光柵光譜儀，高靈敏度光電接收系統(tǒng)等也相繼研制成功，拉曼光譜儀也開(kāi)始與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)使用。
70年代中期，多譜線輸出激光器和可調(diào)諧連續(xù)譜線激光器投入生產(chǎn)，使得拉曼探測(cè)方法的一個(gè)分支-共振拉曼技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。激光拉曼探針也在同時(shí)期誕生，主要用于樣品微區(qū)分析、表面均勻性檢測(cè)等。
90年代初，拉曼光譜分析技術(shù)發(fā)展日益完善。例如：光纖測(cè)量遠(yuǎn)距離樣品，聲光調(diào)制器(Acoustic-optic modulator，AOM)作為分光器件測(cè)量物體等。英國(guó)Reinshow公司和美國(guó)Spex公司相繼推出了共焦激光拉曼光譜儀。Dilor公司結(jié)合拉曼技術(shù)推出多測(cè)點(diǎn)在線工業(yè)，光纖長(zhǎng)度高達(dá)200m，從而使拉曼光譜的應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛。
從20世紀(jì)末到本世紀(jì)初，隨著紫外與紅外激光光源的工業(yè)使用，探測(cè)技術(shù)的提高、光纖耦合技術(shù)以及微機(jī)械技術(shù)的發(fā)展，拉曼光譜儀已被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、結(jié)晶學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。
4.1.3拉曼光譜分析系統(tǒng)
在線拉曼光譜分析系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)如圖所示，主要由五個(gè)部分組成，包括激發(fā)光源、拉曼探頭、光譜儀、檢測(cè)器和拉曼分析軟件。首先由激光器產(chǎn)生單色光經(jīng)激光光路傳輸后照射于被測(cè)樣品激發(fā)散射光，散射光收集光路聚焦后經(jīng)收集進(jìn)入分光系統(tǒng)-光譜儀，光譜儀內(nèi)部須設(shè)置濾光片以濾除強(qiáng)瑞利散射，經(jīng)濾波后的拉曼散射光由檢測(cè)器記錄，并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)進(jìn)入計(jì)算機(jī)，*終由分析軟件根據(jù)所獲得的光譜數(shù)據(jù)得出分析結(jié)果。在這個(gè)過(guò)程中光源、光譜儀、檢測(cè)器的選擇對(duì)所獲得的拉曼光譜質(zhì)量有著重要影響，而*終在計(jì)算機(jī)上所運(yùn)行的分析模型決定了樣本待測(cè)屬性分析結(jié)果的正確性。下面就光源、光譜儀、檢測(cè)器和光譜分析模型四個(gè)方面做一簡(jiǎn)單討論。
激發(fā)光源：使用頻率較高的激發(fā)光源時(shí)，往往會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光干擾背景。若使用紫外激發(fā)時(shí)，所產(chǎn)生的熒光與拉曼信號(hào)頻段相隔較遠(yuǎn)，因此不會(huì)有熒光干擾；用近紅外波長(zhǎng)激發(fā)，熒光信號(hào)弱，因此熒光干擾也較小。能量較高的激發(fā)光源可能會(huì)導(dǎo)致樣品受損，如紫外激發(fā)能量高，容易使樣品受到損傷；而近紅外激發(fā)熱效應(yīng)大，容易使樣品受熱分解。
光譜儀：拉曼光譜儀按分光的原理可分為傅立葉變換拉曼和色散型拉曼兩種。傅立葉變換拉曼光譜儀中*主要的部件是雙光束干涉儀，通過(guò)測(cè)量它所產(chǎn)生的光干涉圖，再對(duì)干涉圖進(jìn)行傅里葉積分變換來(lái)獲得拉曼光譜信號(hào)。色散型光譜儀中*重要的部件是單色儀，單色儀采用光柵結(jié)構(gòu)對(duì)入射光進(jìn)行色散分光。
絕大部分FT拉曼光譜儀都采用l064nm的半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，減少了激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。同時(shí)由于原理上的優(yōu)勢(shì)，更易于和FT-IR紅外光譜儀聯(lián)用，并且具有較高的光譜分辨率和優(yōu)良的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度。但體積較大，測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)，且樣本顏色較深時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較大的測(cè)量噪聲等缺點(diǎn)限制了FT拉曼的在線應(yīng)用。
色散型拉曼光譜儀通常采用532nm或785mn半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源。由于色散型拉曼采用的CCD檢測(cè)器具有更低的暗噪聲和更高的量子效率。因此，同F(xiàn)T拉曼相比，色散型拉曼具有更好的靈敏度和更低的檢測(cè)下限；同時(shí)光柵色散的原理優(yōu)勢(shì)使得數(shù)據(jù)獲取時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于FT拉曼.
探測(cè)器：早期的拉曼分析系統(tǒng)中使用光電二極管(PD)和光電倍增管(PMT)作為檢測(cè)器來(lái)記錄拉曼光譜。自二十世紀(jì)80年代后期，電荷耦合元件(CCD)開(kāi)始被應(yīng)用于拉曼光譜系統(tǒng)。CCD陣列檢測(cè)器結(jié)合了光電二極管和倍增的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有光譜響應(yīng)范圍寬、分辨率高、功耗低和尺寸小等優(yōu)點(diǎn)。
計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)：基于光譜數(shù)據(jù)的分析過(guò)程可概括為三個(gè)步驟，包括光譜預(yù)處理、建立回歸模型、利用回歸模型對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行分析。從光譜儀獲得的拉曼光譜除了包含被測(cè)物的拉曼信號(hào)，還包含干擾信息，如熒光背景、檢測(cè)器噪聲、激光器功率波動(dòng)等。通常情況下，設(shè)備的改進(jìn)并不能完全消除以上干擾。因此在建立回歸模型之前需要利用某種數(shù)學(xué)方法消除光譜中的各類干擾因素，突出被測(cè)物質(zhì)的特征信號(hào)。建立校正模型是以訓(xùn)練集合中標(biāo)定的樣本分析值和預(yù)處理后的拉曼光譜為基礎(chǔ)，通過(guò)某種算法構(gòu)建兩者之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。*終將待測(cè)物的拉曼光譜輸入給分析模型，得到分析結(jié)果。
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